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电转化仪 | 恒定电流,为输卵管原位电穿孔i-GONAD技术保驾护航 巫楚君 北京倍辉科技 2022-03-22 17:14

来源:www.spzjgc.cn 发布时间:2022年05月19日
恒定电流为输卵管原位电穿孔i-GONAD技术保驾护航

CRISPR动物基因组工程广泛应用于研究中,该方法包括三个主要步骤:受精卵的分离,显微注射,以及将显微注射的受精卵转移到假怀孕雌性的输卵管中。这些步骤要求技术人员具备非常高的专业素质,以及昂贵的配套设备。

2015年GONAD技术应运而生,首次证明了可直接在输卵管上对受精卵进行原位电穿孔,生产基因组编辑小鼠,成功简化了CRISPR动物基因组工程的三大步骤。注入输卵管腔内的外源基因组编辑组分被整合到2细胞胚胎中,基因组在目标位点被编辑。这种技术被命名为“通过输卵管核酸输送进行基因编辑”,也就是GONAD技术。使用GONAD技术,可以在不需要离体处理胚胎的情况下进行CRISPR / Cas9介导的靶向基因组编辑。

在此基础上,来自日本东海大学的Dr. Ohtsuka借助日本BEX公司CUY21EDIT II电转化仪又发明了一种i-GONAD技术(东海大学和BEX公司共同申请专利),i-GONAD是GONAD的升级版。采用CUY21 EDIT II电转仪导入CRISPR RNPs:Cas9蛋白/Cpf1蛋白和gRNA到第0.7天孕鼠体内。i-GONAD技术比受精卵电穿孔和显微注射操作更便捷,比GONAD技术更高效(基因编辑效率,GONAD约为25%,i-GONAD约为97%),使得动物基因组工程技术能够在更多的实验室中进行。


i-GONAD的发明者Dr. Ohtsuka在文章中着重推荐了CUY21 EDIT II的恒流电转模式,恒流对于实验获得可重复性有着重要的作用。每只老鼠的肥胖率因个体而异,而且每次实验中输卵管周围的环境也不同,如电极的距离、PBS在输卵管中的浸泡情况等,这些问题都会导致阻抗(电阻)的变化,即使使用的电压相同,电流也会因为阻抗的变化而变化。我们都知道,电流会在细胞表面造成损伤和孔洞,电流过大会导致细胞死亡,具有恒流模式的电转仪可以更好的保护细胞。


图片图1. i-GONAD流程概述

1、准备CRISPR试剂:

设计crRNA

准备DNA模板

2、i-GONAD实验步骤:

准备怀孕的雌鼠

准备基因编辑试剂溶液

手术暴露输卵管和注射

体内电转

3、分析步骤:

基因编辑评估

图片

图2. 体内电穿孔示意图

图片

图3. i-GONAD程序所需的设备和仪器


a.i-GONAD方法所需的主要仪器和材料

b.i-GONAD方法所需的手术器械和材料

c.体式显微镜

d.电转仪(BEX, cat. no. CUY21 EDIT II)和电极(BEX, cat. no. LF650P3)


整个i-GONAD流程不需要分离受精卵以及精密的显微注射步骤,只需一些常用的手术器械以及CUY21 EDIT II电转仪即可完成。

此外,根据Ohtsuka和Gurumurthy等人的说法, i-GONAD/ GONAD 常用于杂交小鼠,如B6C3F1(C57BL / 6和C3H / He之间的杂交种)和ICR小鼠,而不是近交系C57BL / 6(B6)小鼠,且发现用于杂交小鼠和ICR小鼠的电转条件对B6胚胎的发育有害。Ohtsuka等人证明,使用BEX CUY21 EDIT II电转仪应用恒流模式进行i-GONAD时,可成功获得基因编辑的B6后代。可见,恒流模式对于细胞更具有保护作用。

图片电转化仪CUY21 EDIT Ⅱ

图片

CUY21 EDIT Ⅱ多模式高效基因电转化仪,可将外源基因高效导入到原代细胞等难转染细胞、细胞系、受精卵、动物组织或器官中,不依赖于特殊的转染试剂即可实现高效转染,是一款真正的多模式,全功能基因电转化仪。


参考文献

[1]Ohtsuka, M., Sato, M., Miura, H. et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol 19, 25 (2018).

[2]Kobayashi Y, Aoshima T, Ito R, Shinmura R, Ohtsuka M, Akasaka E, Sato M, Takabayashi S. Modification of i-GONAD Suitable for Production of Genome-Edited C57BL/6 Inbred Mouse Strain. Cells. 2020 Apr 13;9(4):957. 

[3]Gurumurthy,C.B.,Sato,M.,Nakamura,A. et al. Creation of CRISPR-based germline-genome- engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc 14, 2452–2482 (2019).