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为新一代测序样品质量保驾护航 ----美国DeNovix公司超微量/荧光全功能光度计

来源:www.spzjgc.cn 发布时间:2021年09月27日


对于新一代测序,待测样品的质量和浓度,是文库成功构建的两个非常关键因素,也是新一代测序成功与否的关键。它可以最大程度上减小序列的偏差,并且输出可靠的序列信息。严格把关送测样品的浓度和质量,是确保新一代测序的数据准确、以及高通量的关键。

 

紫外可见光全光谱扫描的微量模式

 

定量核酸的浓度是借助吸光度值来判断的。核酸的吸收峰是在260nm,在该波长下的吸光度值可以直接通过朗伯比尔定律计算得到浓度值。吸光度值还可以提示样品的污染情况,依据不同的物质混合在核酸溶液中造成吸收光谱中临近260nm的位置发生变化。

 

对于基因组和蛋白质组学,超微量测量方式以测量快速,节省样品(1ul或更少)更加受到科研人员的青睐。而且省去了稀释样品的环节。

 

定量核酸260nm的吸收峰值来判断样品浓度,但无法做到区分核酸的种类。例如ssDNA, RNA, 寡核苷酸,这些物质都会作为目标dsDNA的污染物存在,并直接导致测量时260nm下的吸光度值增加,从而导致目标dsDNA的浓度值被高估。所以紫外吸收法只针对于纯化的样品。

 

荧光定量方法

荧光定量方法是用荧光基团有选择性的结合目标生物分子的性能来实现的。当荧光结合在靶标上之后,荧光的强度即代表靶标的浓度。

 

基于这种原理,将发射出来的荧光强度直接和溶液中生物分子的浓度相关联。通过将荧光试剂与已知浓度的样品混合,然后测量其相对荧光当量(RFU),建立起一条浓度和RFU相对应的标准曲线。那么,将待测样品同样和荧光试剂进行混匀,检测到的荧光信号RFU和标准曲线进行比对,得到待测样品的准确浓度。荧光试剂的特异性,是荧光法检测样品浓度的关键。保证研究者得到的数据是靶标样品的准确浓度。

由于荧光基团具有非常高的消光系数,荧光法通常更加精准。使用DeNovix 公司DS-11FXdsDNA定量分析试剂盒,可以检测到低至0.5 pg/uLdsDNA母液样品。这比紫外吸收法的测量下限降低了1000多倍。这个方法使测量的灵敏度显著提高。

 

绝大多数的新一代测序服务商,都会建议客户使用荧光试剂盒对送测样品进行定量,如DeNovixPicoGreenQubit等。这些试剂盒中的染料特异性的结合在dsDNA结构上,不会和其他核酸结合,从而保证得到的数值是溶液中dsDNA的准确浓度,不会受到其他物质的干扰。

 

样品评估纯度

 

除去精准定量浓度,还有一个重要的功能,就是排除潜在的酶抑制剂,如蛋白质,EDTA,苯,盐离子还有多聚糖等,都会给后续的酶促反应带来负面的影响。表现为降低产量,弱覆盖率,甚至是文库构建的失败。超微量全光谱扫描UV-VIS建议用来监控样品纯度。通过评估260/280以及260/230的数值,样品的纯度以及混有的杂质种类即可知道。

 

结论

 

紫外可见光吸收法和荧光法虽然截然不同,但是都是进行样品定量的黄金法则。对于新一代测序实验室,结合荧光法和紫外吸收法,只需要很少的量(1uL),就可以确保研究者获得样品的浓度和质量信息。给后续实验以指导。

 

为了满足新一代测序实验室的研究需求,美国DeNovix新款DS-11FX/FX+结合了超微量吸收法和荧光法两种检测模式。检测能力覆盖了目前最宽的样品浓度范围。只需要购买一台仪器,即能满足科研中,所有测量浓度的需求。已经成为新一代测序实验室必备仪器。