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荧光检测功能在蛋白,核酸及其他样品浓度检测中的应用

来源:www.spzjgc.cn 发布时间:2021年09月24日

美国Denovix推出了DS-11FX系列超微量/荧光全功能分光光度计,极大拓展了样品浓度检测应用,让我们可以重新了解自己的样品,为下游实验及品质控制提供准确的数据。


哪些样品建议选择DS-11FX?我们列举几个重要的应用:


1.二代测序样品,文库构建,刑侦法医

样品量极少,起始模版浓度很低等情况下需要荧光进行准确定量,DS-11FX最低检测浓度可达0.5pg/ul dsDNA.


2.实验室样品种类多:既有极低浓度的样品也有高浓度样品

DS-11FX的浓度测量范围:0.5pg/ul - 37500ng/ul dsDNA,可以覆盖实验室全部样品。


3.样品未纯化,含有RNA或降解的DNA.

如粗提的总蛋白中,除了蛋白质还会有降解的DNA和未去除的RNA等,要想得到蛋白质的浓度,即可用荧光法针对蛋白质进行特异性的检测。


4.Buffer成分复杂,使UV-Vis测量不够准确

有很多buffer在UV-Vis的260nm或280处有吸收,这样就会影响样品的浓度检测。下面就是举例说明哪些buffer会在260nm或280nm干扰样品的吸光值。例如,下面这些buffer就是实验中非常常见的:


(1)纯化后的蛋白中含有去污剂

大多数离子去污剂会干扰紫外线(UV)分光光度法,因为此类去污剂都含有一个可以吸收紫外线的苯环。因此,280nm紫外线波长下检测蛋白质吸光度会变的不准确。中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室,是我们国家从事蛋白研究的最好的机构之一,近期该实验室共购买了三台DS-11带荧光检测功能的超微量,其中主要应用之一就是检测含有去污剂的纯化后的蛋白浓度。


特别提示:在生物学或生物化学实验室使用的去污剂都是作用比较温和的表面活性剂(=表面活性成分),是用来破坏细胞膜(裂解细胞)以释放细胞内的可溶性物质。它们可以破坏蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质、脂质-脂质之间的连接,使蛋白质发生结构上的变性,防止蛋白质结晶,另外在免疫学实验中还可避免非特异性吸附。


残留去污剂的类型及浓度会对实验有一定影响,因此通常需要降低或者清除残留的去污剂。目前去除去污剂的方法都很麻烦,所以,很多实验室很少对去污剂进行处理。况且,在去除去污剂后,还需要格外注意防止蛋白质的沉淀和聚集。


(2)DNA样品中含有残留的酚类

苯酚在紫外范围有很强的吸收,很小量的苯酚就能提取DNA,而苯酚的存在就会干扰DNA样品在260nm处的吸收值。

特别提示:使用苯酚抽提细胞 DNA ,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用


(3)样品中含有 Trizol

Trizol是一种提取DNA,RNA,蛋白质的buffer。如果样品中没有完全去除这种buffer,就会干扰在260nm和280nm处的定量。


特别提示: TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNATRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。


(4)样品中含有RIPA裂解液

通常用于蛋白裂解,主要是从动物组织和动物细胞中抽取的可溶性蛋白。如果未纯化好的样品,含有这种物质,就会影响蛋白质的定量。

特别提示:RIPA解液(RIPA Lysis Buffer) 对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有较强裂解作用,可能是经典但最常用的细胞组织快速裂解液。


5.我想知道混合物中DNA,RNA,蛋白质分别的含量

纯化后的样品中,检测是否还含有其他杂质。例如蛋白质纯化后,可用荧光法检测是否还含有微量的DNA或RNA,可用于精密实验的品质控制。


6.可以对某种糖物质或是酶的浓度进行测量。

举例:一种硼酸荧光分子探针经过简单的化学修饰。这种基于Bodipy的荧光染料分子中的硼酸基团,能够以共价键牢固地与被分析物结合,解决了普通荧光探针不能在水溶液中使用的难题。该类探针化合物的激发和发射波长均在可见光区;在近中性pH的实用检测范围内,对葡萄糖、葡萄糖酸、酒石酸等有很好的选择性;具有很好的灵敏性。该探针化合物可用于实现以荧光方式对葡萄糖进行检测。糖类、糖酸类及其相关分子在生物有机体的新陈代谢中、以及疾病诊断治疗(如糖尿病等)有着非常重要的意义。识别生物有机体中的糖以及糖酸类化合物,并定量测试其在水溶液中的浓度,对于医学和生物学都有重要的意义。