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电转化仪高效转染mRNA进入小鼠受精卵形成基因组稳定突变体

来源:www.spzjgc.cn 发布时间:2021年09月24日

摘要

随着小鼠基因组序列测序完成,许多研究都围绕着功能基因参与的生物学过程,特别是发育和疾病研究领域。那么稳定遗传修饰的模型动物对于阐明基因的作用十分重要,然而,传统的方法,包括在胚胎干细胞中的同源重组或是构建小鼠嵌合体,既耗时又耗力。然而新的基因组编辑方法明显的优化这个过程。在有效的基因组编辑方法中,CRISPR/Cas9系统是构建携带修饰基因组最简单的方法。

虽然,CRISPR/Cas9系统简化了形成突变体的过程,但是将DNAs/RNAs微注射入受精卵需要特殊的技术,得到大量的突变体也十分耗时间(注射数以百计的受精卵)。那么,为了简化这个过程,我们尝试用电转化仪将RNA导入受精卵。

电转也被用于过小鼠受精卵,但是过程涉及去除卵透明带,或是用酸台氏液薄化处理,这些对细胞是非常有毒性的,而且只有短小的RNAs(短于1kb)可以被导入。

近期,一只大鼠突变体成功构建,借助于在保持卵透明带完好的前提下转染Cas9mRNA和gRNA入大鼠受精卵。然而基因组编辑的效率很低(低于9%),而且需要大量的Cas9(1000-2000ng/ul)。


方法与结果

为了优化电转条件,我们使用BEX CUY21 EDIT II电转化仪,以及铂金块电极,1mm间隔(图1abc)。放在体视显微镜下,并连接电转化仪。每次加入5ulRNA,可以电转40-50个胚胎。

Figure 1. Optimal conditions for the electroporation used todeliver mRNA into fertilized eggs. (a)Electroporation set-up used in this study. The right box is theelectroporator CUY21 EDIT II (BEX Co.Ltd.), which generates electric pulses,and the left is a stereoscopic microscope for embryo manipulation. Twoelectrodes were placed on the microscope stage and connected to theelectroporator.

Figure 2. CRISPR/Cas9-mediated genome editing by electroporation. (b)Examples of embryos from the three classes that exhibited differentlimb phenotypes: no limbs (type I), limb defects (type II, left hind limb deficiency,right: truncated fore- and hind-limb), and normal (type III). (c) Graph summarizing the effects of Cas9 and gRNA electroporationon limb development. The concentrations of RNAs used in each experiment areshown at left The numbers in each column are the number of embryos exhibitingthe phenotype in each category

Figure 3. The single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN)-inducedgeneration of HDR-mediated
insertions. (b) 
Representative embryo electroporatedwith Cas9 mRNA, gRNA, and ssODN. ThemCherry florescence completely disappeared in the electroporated embryos, whilecontrol (no electroporation) embryos displayed florescent signals.

讨论

综上所述,我们确立了一个电转条件,保证基于CRISPR/Cas9的基因组编辑的高效和高存活率。因为电转染不需要微注射技术,而且可以同时对40-50个胚胎进行处理,这种方法较之以前的方法能更快更简单的得到大量的稳定遗传突变体小鼠。应用这个方法,可以为分析F0表型进而筛选发育相关重要基因奠定基础。