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BEX CUY21 EDIT II在体输卵管基因编辑方法

来源:www.blmscc.cn 发布时间:2021年09月10日

摘要

我们建立了一个方法,通过输卵管递送核酸的方法进行基因编辑( i-GONAD)。将CRISPR核糖核蛋白通过原位转染进入E0.7的小鼠胚胎中。这种方法生成单碱基变化,千碱基缺失或是敲入。和传统的显微注射的方法(在体外处理受精卵并需要移植回受体动物)相比,i-GONAD避免了技术操作的难点,使得通过简单仪器以及简单的操作即可实现。另外,i-GONAD处理过的孕鼠依然保留了生殖功能,这一方法可以用于建立生殖系统的基因治疗。

在这篇文章中,我们对于GONAD进行了优化。命名该方法为发展的GONAD(i-GONAD),因为他使得基因编辑效率有了大幅提高。我们阐述了i-GONAD方法可以创造生殖系统优化的G1后代,在基因上面有大量的缺失和敲入。同时,我们阐述了i- GONAD是简单易操作的。

结果

GONAD E0.7

在我们前期的工作中,我们试验中采用的交配后1.5~1.7天的。在这个阶段,胚胎一般都是2细胞阶段。递送基因编辑的试剂会导致嵌合体的大量存在。理想的导入基因编辑试剂的时间一般应该是在单细胞胚胎时期,因为此阶段会大大减少杂合体的数量。为了对比基因编辑复合物递送的最早时间,我们在两个阶段进行GONAD测试,一个是0.4天一个是0.7天。我们注射1.0-1.5ul的溶液,里面含有eGFP和信使RNA(mRNA)(1ug/ul)以及台盼蓝进入输卵管腔(图a)


m RNA递送两天后,分离得到8细胞胚胎观察eGFP荧光。在0.4天进行电转染的胚胎中我们没有观察到eGFP信号。然而在0.7天处理的孕鼠中,我们观察到31个胚胎中有13个具有绿色荧光信号。因为在0.4天的时候卵丘体紧紧地包裹在卵子的周围,所以会阻碍质粒进入受精卵。相对地,0.7天时大多数受精卵已经没有厚厚的卵丘细胞,允许注射的物质直接进入受精卵。这些因素决定了交配后的0.7天是最适合做GONAD的。

将退火的cr RNA+tracr RNA+Cas9蛋白质复合物注射入7只0.7天的Jcl:MCH(ICR)孕鼠输卵管内腔,输卵管利用CUY21 EDIT II进行在体电转染。分离E13.5或E17.5的胚胎进行分析。所有7只孕鼠均有子代(共36只)。令人惊奇的是,几乎所有子代均含有插入突变体(35/36,效率高达97%)

应用CUY21 EDIT II电转染仪针对两只母鼠,在E14.5分析子代。10只子代,5只(50%)表现出基因型和表现型改变(眼睛的色素沉着或毛色变化)

而且,涉及到基因矫正以及缺失插入,大约有89%(66/74)的G0后代是基因编辑的。这个结果也进一步支持了i- GONAD的效率更高。

和显微注射相比i- GONAD的优势

35只超排卵的Jcl:MCH(ICR)孕鼠体外受精形成受精卵。我们向339只受精卵注射CRISPER 试剂,并进行培养。其中242只(71%)发育成2细胞阶段,转化至12只受体母鼠体内。母鼠在E14.5和E15.5进行麻醉。62只子代中,32只(52%)具有色的眼睛。测序分析显示,有色眼睛的子代在基因组相应的位置有基因编辑。79%的G0代子代有基因编辑。显微注射的嵌合体(43%)相对于i-GONAD(61%)会更低一些,但是不是显著性差异。但是,采用显微注射进行基因编辑显然比i-GONAD要花费更多的动物个体:显微注射法需要20只动物,而i-GONAD只需要8只。

i-GONAD应用在不同的小鼠品系上

接下来我们在近交系和杂种小鼠品系和额外的基因座上验证了i-GONAD的性能。i-GONAD在C3H/HeSlc,C57BL/6NCrSlc,DBA/2CrSlc,B6D2F1/Slc,和杂合体B6D2F1/Slc,C57BL/6NCrSlcTyr基因引入插入突变体。结果显示i-GONAD在基本所有的品系上的基因座上面均有进行基因编辑,除去C57BL/6NCrSlc小鼠。综上所述,i-GONAD可以用于大部分的小鼠品系,虽然在不同品系上面的效率略有差异,但是可以通过后期的优化进行提高。

i-GONAD的应用性和优势

GONAD方法,不用进行离体受精等体外的工作,直接将基因编辑用的核酸在活体的情况下直接导入到输卵管中。对比体外基因转染,具有很多的优点:1)i-GONAD不需要体外处理胚胎;2)省去体外培养胚胎的过程;3)不需要假孕的母鼠,用来将体外编辑的受精卵移植进体内,进行繁殖;4)不需要输精管切除的公鼠去形成假孕母鼠。5) GONAD处理的母鼠不需要被处死来得到受精卵。另一个非常重要的优势就是GONAD处理的母鼠还具备生育能力,还可以进行第二次的GONAD过程。这是非常重要的特性:原因是1)用于GONAD实验的小鼠是非常有价值的,2)在这个品系上可以立即进行第二个基因编辑操作。

结论

本文中建立的i-GONAD方法,首先,相对于传统的显微操作,不需要复杂的设备或高超的特殊技巧;其次:节省60%的动物;第三,实验用的母鼠可以重复利用,不会被处死。第四,可以适用于其他的动物如大鼠,啮齿动物,灵长类动物和其他大型动物。这个方法同样适用于非常珍贵非常有价值的动物,不能被牺牲的动物。

参考文献

I-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Ohtsuka et al. Genome Biology (2018)  
https://doi.org/10.1186/s13059-018-1400-x